1
标准曲线 / 绝对定量
使用已知起始量 x 与 Ct 建立 Ct = slope × log10(x) + intercept。软件按“基因/检测项目”分别拟合，可将多条曲线叠加在同一图，并在图内显示方程与 R²。
log₁₀(x) = (Ct − intercept) / slope
x = 10(Ct − intercept) / slope
Efficiency = (10−1/slope − 1) × 100%
dsDNA copies/µL = ng/µL × 10−9 × 6.022×1023 / (bp × 660)
原液 copies/µL = copies/反应 ÷ 模板加入量 × 稀释倍数
- 每个检测项目至少 3 个不同浓度，建议 5–7 个梯度。
- Unknown / NTC 的检测项目名称必须与对应 Standard 完全一致。
- 建议 R² ≥ 0.98；本工具默认低于 0.95 判为风险。
- 扩增效率通常以 90%–110% 为理想，工具默认 80%–120% 为可接受边界。
2
2−ΔΔCt 法
先用内参校正样本间投入差异，再用校准组作为相对表达基线。
ΔCt = Cttarget − Ctreference
ΔΔCt = ΔCtsample − mean(ΔCtcalibrator)
Relative expression = 2−ΔΔCt
- 目的与内参基因扩增效率应相近且接近 100%。
- 校准组的组均值约为 1，但单个样本可上下波动。
- 生物学重复先逐个计算，再进行组别汇总。
3
双标准曲线法
分别用两条回归方程将目的与内参 Ct 换算成起始量，不要求两者扩增效率完全一致。
Qtarget = 10(Cttarget−btarget)/mtarget
Qref = 10(Ctref−bref)/mref
Normalized = Qtarget / Qref
两条曲线都必须覆盖待测样本 Ct 范围；超出标准曲线范围的外推结果会单独预警。
4
试剂评价
只有相同样本、投入量、引物和仪器条件的数据才能直接比较。反转录酶建议使用同一批 RNA；qPCR mix 建议使用同一批模板。
CV(Ct) = SD(Ct) / mean(Ct) × 100%
Detection rate = 有效 Ct 数 / 计划复孔数 × 100%
Relative yield = 2−(Ct−Ctbest matched) × 100%
推荐同时审阅扩增曲线、熔解曲线、NTC、标准品线性以及低浓度检出一致性。
5
加标回收率
同一系列、同一检测项目内，用加标样的实测值扣除基线样实测值，再除以已知加标量。多个加标水平时，以加标量为 x、回收量为 y 拟合回收曲线。
回收量 = 加标样实测值 − 基线样实测值
回收率 (%) = 回收量 ÷ 加标量 × 100%
回收曲线：回收量 = slope × 加标量 + intercept
- 基线可选择“未加标”或“NCS”，含义以试剂盒说明为准。
- 实测值留空时，软件调用第 1 页同名检测项目的标准曲线由 Ct 反算。
- 默认 80%–120% 仅为可编辑筛查范围，不替代方法学验证标准。
- 公式参考：US EPA Method 1632A（Percent recovery = 100 × (A − B) / T）。
6
本地项目管理
V3 使用浏览器 IndexedDB 保存多个实验项目，输入后约 0.7 秒自动保存。项目包含实验信息、阈值、所有原始 Ct、复孔排除标记和当前页面。
保存位置 = 当前浏览器 + 当前网站域名
云端上传 = 否
跨设备恢复 = 导出 / 导入 .qpcr-project.json
- 更换浏览器、设备或网站域名时，本地项目不会自动同步。
- 清理网站数据前，请先使用“导出项目”备份。
- V3 可导入 V2 或 V3 的项目备份；V2 浏览器项目不会被自动覆盖。